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このページに訪れた方へ 中学・高等学校現場での線虫の教育利用の普及を目的に、このサイトを公開いたしました。 公開当時からは20年以上が経過し、私は半リタイア、お世話になった東大の飯野雄一先生もご退官され、線虫の提供体制も含めて、当時とは大きく状況が変わったこともあり、サイトの閉鎖も考えましたが、線虫を初めて手にした時の驚きや感動、初心者目線での内容は、線虫に関心を持ち、同じように初めて線虫に触れる高校生や高校の先生方の参考になるかと思いましたので、当面は当時の内容のまま公開を継続することに致しました。 線虫の入手方法については、下記の「虫の集い」で線虫の提供体制の継続が検討されていると伺っておりますので、線虫を使って実験・研究を希望される方は「虫の集い」のホームページをご覧いただき、線虫の提供についてご相談下さい。 なお、大学・研究機関の方は、ストックセンター（Caenorhabditis Genetics Center, CGC）から提供を受けられますので、同サイトにて送付依頼をして下さい。（高校関係の方もこちらから提供を受けられるそうです。）（2024年4月更新) 法政大学国際高等学校 鈴木恵子
線虫の入手先 虫の集い http://www.wormjp.umin.jp/ ストックセンターCaenorhabditis Genetics Center, CGC http://www.cbs.umn.edu/CGC/ このサイト公開の経緯 2003年「ゲノムひろば」において、東京大学遺伝子実験施設の飯野雄一先生より、C.elegansを分けていただき、培養や実験に関するサポートいただき、初期のやりとりをこのサイトにて公開しております。高校などにおけるセンチュウの利用の参考になれば幸いです。 また、センチュウの教材化に取り組んでいます。高校現場でも可能な手抜き培養の仕方や観察方法などです。サイト末の参考サイト（啓林館）に公開中ですので、そちらをご参照ください。 法政大学女子高校 鈴木恵子
線虫が高校の教育の現場にどの程度そぐうものか、私には十分状況が分かりませんので判断できませんが、もし飼育、観察が可能なようでしたら、ぜひ役立てて頂きたい と思います。 生徒さんたちに、生命の営みにじかに触れて感動を得てもらうことがで きれば、理科教育の最大の成果になるのではないかと思います。初期卵割なども、見 る見るうちに細胞分裂が進みますのでワクワクします。線虫を切って卵を取り出すの は簡単ですので可能性があると思いますが、観察には微分干渉顕微鏡が望ましいので、そこが問題かも知れません。 ご不明の点等、ありましたらできる限り協力させて頂きたいと思います。ぜひ飼ってみて下さい。 東京大学遺伝子実験施設 飯野雄一 メールでのやり取り 早速初歩的質問ですが、3点ほど質問いたします。 1.プレートで冷蔵保存しておいた大腸菌を、液体培養で増やしてから餌とするのは構わないでしょうか？ それとも液体のまま、次のプレート作成時まで冷蔵保存できますか？ 2.大腸菌やセンチュウの植えつぎは、バーナー下の無菌状態で行なうものでしょうか？ 3.観察には微分干渉顕微鏡が望ましいの とのことですが、とてもそのようなものは用意できません。通常の顕微鏡でよいでしょうか？ 以上、よろしく、お願い致します。 1.プレートで冷蔵保存しておいた大腸菌を、液体培養してから餌とするのは構わないでしょうか？それとも液体のまま、次のプレート作成時まで冷蔵保存できますか？ いずれでも構いません。プロトコールではプレート上での大腸菌の扱いに慣れていらっしゃらない方のことも想定し、できるだけ簡単に書いてあります。しかし実際は、液体培地から液体培地に薄めて増やしなおすことを繰り返して維持するのはベストのやり方ではありません。といいますのは、OP50は通常のLBなどの培地では増殖が遅いウラシル要求性の株です。大腸菌が厚すぎると線虫の観察や操作がしにくいので、わざと増えの悪い大腸菌を使うことになっています。そのせいか、時々増殖の速い変異株が生じるようです。こういった変異株は絶対使えないということはないのですが、元の大腸菌とは多少変わってしまっているので、通常は避けます。このために、時々プレート上に広げてシングルコロニーを拾い、液体培地に植えて増殖させます。私どもは、通常は最初にご指摘されたように、プレート上に広げたものを作っておき、そこから液体に植えています。それを液体に植え次ぐこともします（というより、残り少なくなったら培地を足す）が、時々はプレートに戻って生やしなおします。ところで、先生は大腸菌のストックというのは作られますか？大腸菌の培養が死ぬ前に植え次ぐことを続けるのは大変なので、できれば半永久的に保存できるストックが望ましいと思いますが、私どもはグリセロールストックという形で-70℃のフリーザーで保存しています。常温で保存できるスタッブという方法があるはずですが、私は作り方を知りません。高校でどうされているか、興味があります。 2.大腸菌やセンチュウの植えつぎは、バーナー下の無菌状態で行なうものでしょうか？ 私どもは基本的な操作はバクテリアの無菌操作に準じた方法で行っています。ガスバーナーを炊きながらやるやつです。但し、大腸菌の操作は全くその通りで構わないのですが、線虫は至的温度が20℃ですから、暖めすぎると弱ります。そばでバーナーを炊くと必ず線虫のプレートが温まりますので、線虫の植え継ぎをやるときは、種火だけにして、線虫の植え継ぎのためのピックを焼いて滅菌したり、寒天を切り取るためのスパーテルをアルコール滅菌したあとフレーミングするために使っています。言い換えると、線虫の植え継ぎのときは、雑菌の混入を防ぐためにバーナーを炊くことはしません。実験室の環境にもよると思いますが、私たちはそれで不自由を感じません。プレートにカビが生えることが一番心配ですが、カビを見つけてすぐに切り取って捨てればそう問題にはなりません。カビがひどいようでしたら、ナイスタチンという薬剤をプレートに入れることによりカビ止めになります。 それから、雑菌やカビが線虫に混入したときに、クリーニングする方法があります。ブリーチと呼んでいますが、名の通り、漂白剤の成分、次亜塩素酸ナトリウムで線虫を処理します。正確には線虫の卵です。線虫や雑菌はブリーチで分解し、死にますが、線虫の卵は卵殻があるために薬剤が入らず、生き残ります。これを利用して、雑菌を除く方法です。これは有用だと思いますので、プロトコールを添付します。 3.観察には微分干渉顕微鏡が望ましいの とのことですが、とてもそのようなものは用意できません。通常の顕微鏡でよいでしょうか？ よく線虫の紹介写真などで示されているような、細胞の核がへこんで見える像は微分干渉顕微鏡のものです。通常の明視野顕微鏡ではああいうふうには見えないと思いますが、線虫の体の構造や細胞が分裂している様子はある程度分かるのではないかと思います。実はあまり見たことがないのではっきりお答えできないのですが。 Bleach のかけ方（線虫のクリーニング） ・コンタミのバクテリアやカビを除くとき ・同調などの目的で卵（胚）だけを単離するときなどに使う。Bleach処理により、線虫の卵だけが生き残ります。 1) Alkaline bleach mix を作る。1N NaOH : ブリーチ（花王ハイターなど*）= 5 : 2 に混合する このmixは少なくとも20日間は室温で保存可。 *試薬のNaClOより市販の漂白剤がベター。買うときによく組成を見て、界面活性剤の含まれていないものを使うこと。ブリーチは古くなると（半年程度以上）、効きが悪くなります。頻繁に買い直す必要がないように、新しいうちに分注して（その際できるだけ空気が入らないようにチューブの上部まで入れる）、-20℃に保存することも有効。 2) 線虫をM9バッファで洗いとってエッペンドルフチューブに入れる。落ちている卵も欲しい場合は大腸菌ごとピペットでこさぎとる感じ。 3) 3000rpm×30"〜1'遠心。 4) 上清を除き、1)のalkaline bleach mixを加えて懸濁。チューブを横にして３分間置く。時々混ぜるとよい。（終盤に線虫が一部壊れ始めるのが見えるはず。） 5) 素早く3000rpm×30"遠心後、上清を除く。すぐ少量（数μl）のM9に懸濁する。ピペットマンで吸い、実体顕微鏡で見ながら、適当な数の卵を餌を塗ったプレートに置く。 （補足）Bleach処理が長すぎると卵が死ぬので、素早く処理できない場合は一回M9で洗った方がよい。 今、実は真夜中の3時になろうかという時間ですが、自宅の顕微鏡でちょっとのぞいてみたところ、線虫の体内で何かがうごめいている個体をみつけました。 卵（か孵化した子）を排出できない変異体があることを思い出し、もしやと思いじっくり観察してみると、親のセンチュウの体内で孵化した子のセンチュウが盛んに動いていることがわかりました。いつ子センチュウは親の体内から脱出するか気になって観察を続けました、かなり遅い時間だったので諦めましたが・・。 周囲には、多少発生が進んだ卵（胚）が散乱し、中には、縄を8の字に巻いたような胚も観察され、これらはそのうち孵化して動き出すのだろうと思いました。 ネット上の写真で体内で胚が8細胞くらいまでなっている写真をみたので、体内である程度まで発生が進んでから産み出すのだろうと思いますが、正確なところはどうなんでしょうか？ また、通常は受精卵か発生がいくらか進んだ胚を排出するとして、先ほどの体内に子センチュウがいた個体は変異体で、珍しいことに遭遇したのか、あるいは、結構あること（みつかるもの）なのか知りたいです。 観察をしていて、水にセンチュウをとると動きが激し過ぎるので、動きを抑える方法はないでしょうか？ 寒天培地の上では動きは遅いのですが、手持ちの顕微鏡では倍率を高くして見ることができないので、スライドガラスにとって観察せざるを得ませんが、動きがかなり早いので、どうしたものかと思っています。 卵を抱えている個体を切って、卵を出させるには、具体的にどのようにすればうまくできるのでしょうか？ まだ試みていないのですが、、道具は柄付き針でいいでしょうか？あるいは、メスですか？おさえなくても、切れるのでしょうか？切ったら、中を押し出す必要はありませんか？ 以上、基本的なことですが、お教えください。 まず、産卵の件ですが、親の体内で受精が起こり、初期発生がある程度進んだ段階（通常、細胞分裂がある程度進んで細胞数が増えているが、細長い虫の形ができる前）で外に産み落とされます。従って、ご覧になっているような、体内で卵が孵化するということはありません。 確かにおっしゃるように、産卵ができない、あるいはできにくい変異体が存在します。egg layingの略でegl変異体といいます。egl-1, egl-2,....と、原因となる遺伝子ごとに番号がついています。しかし、残念ながらご覧になっているのは変異体ではないと思います。 線虫の産卵は餌（大腸菌）の有無により制御を受けます。餌があるときには上記のように卵を産み落としますが、餌がなくなると産卵が抑制されます。この制御は神経系の作用で起こり、神経伝達物質セロトニンが関与していることが分かっています。例えば、餌がなくても、セロトニンを外から加えてやると卵を産みます。横道にそれましたが、おそらくご覧になっている状態で線虫が餌を食い尽くしていてプレート上に餌がなくなっているか、あるいは新しいプレートに移す前に餌がなくなっている状態だったか、ということの効果だと思います。一度こうなってしまうと、産卵孔が詰まってしまうのか、餌を与えても元には戻りません。この現象の意味づけですが、餌がなくなると卵を産み落としても子の生存が危ういので、体内で孵化させて、親の体を餌として少しでも生き延びさせるという涙ぐましい生存戦略だと理解できます。 次に、観察の際に水の中で動いて困るということですが、私どもはアジ化ナトリウム（NaN3）を麻酔剤として使っています。10mMになるように水（あるいはM9などのバッファ）に加えたものを使えば、線虫はじきに麻痺して動かなくなります。 卵を出すためには、体の真ん中で真っ二つに切ればたいてい卵がこぼれ出します。スライドグラス上の浅い水（バッファ）に入れた、暴れている線虫を、タイミングを見計らって上からざくっと切ります。道具は私は使い捨てのメスを使っています。フタバの替刃メスNo15とそれに対応したホルダー（柄）を使っていますが、注射針の先の斜めに切れている部分を使うこともできます。試したことはありませんが、予算が苦しければカミソリでもできるのではないでしょうか。 なお、卵の発生を時間を追って観察する場合には顕微鏡下で発生が継続する必要があるので、浸透圧が適当な溶液を使ったほうがいいと思います。egg salt （118mM NaCl, 48mM KCl）を使っています。 ********************************************************************************** ゲノムひろばでのセンチュウ配布のきっかけを作って下さった、京都大学人文科学研究所の山岸様からのメール ********************************************************************************** 実は最近，昔の後輩（とある線虫ラボの博士課程）と学会で再会する機会があり，研究だけではなくコミュニケーション活動にも興味があるということで，こちらのことをいろいろ教えていました．話のついでに，鈴木先生が飯野先生にお問い合わせをされていた質問の内容を教えると，こんなメールをくれました．飯野先生とのやりとりに口を挟むつもりではありませんが，研究者の回答例のひとつとして，紹介します． 線虫は雌雄同体ですので、自家受精を行います。体内での受精後、２〜３時間後に陰門より産卵されます。産卵のころは原腸胚ぐらい発生が進んでいます。先生が観察していらっしゃていた8の字の形の胚は、かなり発生が進んで１齢幼虫の形がかなりできあがった状態のもので、孵化近いです。 この陰門の形成あるいは機能異常により産卵ができなくなる変異体がいます。これらの線虫は、受精は正常に行われるので線虫の体内に受精卵がたまり、それらが孵化してしまいます。親の線虫はしばらくは生きていられるのですが、最終的には死んでしまい、親の表皮のなかは産まれた幼虫で満たされてしまいます。これらは親の表皮から出てくるので、正常に発生します。飼育培地をよく観察すると、皮だけになった親の体があります。野生型でも時としてそのような個体が出てきますが、変異体も単離されています。 顕微鏡での線虫の観察ですが、水の中に線虫を入れてしまうと動きが激しくて非常に観察しづらいです。スライドグラス上に２％ほどの濃度の溶けた寒天（レンジでも溶かせるので、寒天溶液のストックをつくっておけます）をスポイトで乗せ、固まらないうちに上からもう１枚のスライドグラスを乗せてやると薄く平らに広がった状態で寒天が固まりますのでうまくスライドグラスを１枚外すと寒天の観察ステージができます。この上に線虫を乗せると、培地上での観察と同じように見えます。そのままでは寒天がすぐに乾いてしまうので、少し水を乗せてカバーガラスをかけ、即席のプレパラートにしてもよいと思います。 あとは、線虫に麻酔をかける方法もよいと思います。二酸化炭素や、0.5%濃度のフェノキシプロパノールがあればよいのですが、２〜４℃に一旦線虫ごとスライドグラスを冷やしてやってもしばらくは動きが鈍くなりますので観察しやすくなります。 実際に僕自身が卵を取り出す実験はやったことがないのですが、柄付き針やメスの先端などを利用して線虫を切ることはできます。できるだけ細いものを利用したほうがやりやすいと思います。一旦線虫を切ると、体内の圧力でいろいろでてくるので、卵も取り出せると思います。 ********************************************************************************** じっくり観察すると、センチュウはなかなかおもしろいです。 新しい培地に移植した後、ぽろぽろと卵（胚）が産卵され、その後それらが孵化するところ（動きだすところ）も見ることができました。 卵を出すために切るセンチュウは何匹くらいを切るといいのでしょうか? 卵を多くとるために、複数とって切るということでいいのでしょうか？ だとしたら、何匹くらいがちょうどいいのでしょうか？ それとも、通常1匹ですか？ 一匹では丁度いい発生段階の卵が見つからない可能性が高いので、例えば10匹ぐらいでしょうか。手早くやれる範囲でできるだけ多いほうがいいと思います。 また、発生過程を観察するとしたら、ざっと所要時間はどのくらいかかりそうですか？ 年末に培地に移植したものの観察では、移植して3日程度で、たくさん胚が生み出され、子センチュウが孵化しているようでしたが。 受精から孵化まで20℃で800時間（13時間程度）といわれています。但し、リアルタイムで見ていて面白いのは最初の方だけだと思います。つまり、受精から精子と卵子の核が融合し、そのあと第一卵割、第二卵割と進むあたりが見ていて楽しいです。このころは、大体15〜20分ごとに細胞分裂（卵割）をしますので、うまくやれば90分の授業時間でかなり満足してもらえると思います。そのあとが気になる生徒さんは１時間、とか２時間おきに見に来ると発生が進んでいるのがわかると思います（プレパラートがうまくできていればですが）。800時間と書きましたが、その半分ぐらいで虫の形ができて三つ折になり、動き出すと思います。それ以降は見かけ上孵化まであまり変わりません。初期卵割以降のプロセスは早回しのビデオで見せてもいいと思います。コンピューターのビデオファイルでよろしければ差し上げることは可能です。 話が戻りますが、初期卵割を見せるためには、当然受精直後の卵を見つける必要があります。多数の虫を切った方がいいという理由はここにあります。早く進むプロセスなので、受精直後のものは数が少なく、またすばやく観察まで持っていく必要があります。 また、変異体のことも教えてください。 わかりやすい（高校生でも区別しやすい、わかりやすい、面白い）変異体がありましたら、ぜひご紹介いただき、譲与していただければと考えています。 そうですね。虫の集いのMLにもありましたとおり、またゲノムひろばでもお見せしていたように、変異体は受けがいいようです。長い変異体、短い変異体、水ぶくれのある変異体、動かない変異体、変な動きをする変異体など、いろいろありますので、野生型の飼育に目処がつきましたらいつでもお分けできます。 また、これも虫の集いにありましたように、遺伝学の実習にもいいと思います。C.エレガンスという線虫は雌雄同体と雄という性システムなので、少し特異ですが、理屈どおりの挙動をしますので、遺伝学の練習問題としてはいいと思います。最低２週間ほどの実習期間が必要だと思いますが。 杉本先生の書かれた実習の例がhttp://www.wormjp.umin.jp/jp/index-j.html に載っていますので、将来的にご検討されればいかがでしょうか？ 11月のゲノムひろばでいただいたセンチュウのプレートは、1枚は生徒に実験用に渡し、1枚は12月に植え継ぎに使用し、残る2枚は封をしたままで残していましたが、そのうち1枚はかびが出てしまい、もう1枚がきれいなまま残っています。顕微鏡で見ると、耐性幼虫らしき小型のセンチュウがいます。多くが死骸のようで動かない中、生きていて動いています。 耐性幼虫はそっとしておいた（振動を与えない）プレートでは動かないのが普通だと思います。突っつくと動いたりしますが、それは確かに耐性幼虫でしょうか？ このプレートはその後の観察用にまわすことにして、先生からいただいたプレートで12月に植え継ぎ用に寒天を一部切り出したプレートからさらに寒天片を切り出し、今回作ったプレートに移したところ、センチュウの動きが活発になったようです。これが、耐性幼虫と考えていいのでしょうか? 耐性幼虫も普通の幼虫も（死んでいない限り）新しいプレートに移すと動きが活発になります。 耐性幼虫、どんなものかよくわかりません。 ゲノムひろばでいただいたプレートの幼虫なので、そうなのではないかと思ったのです。もう、2ヶ月たってますので。カビも生えずまったく触ってない（開けてない）プレートの方は、ほとんど幼虫は動きません。ほんの一部が動いてます。動かないのは、まるで死骸のようなので、それらの中で動いているのは耐性幼虫かと思いました。 あまりよい写真は取れないのですが、写真を添付しました。添付した写真の右下のはゆっくり動くので耐性幼虫で、ほかのは死んでるように見えますが、いかがでしょうか?死骸のようなものでも、実は耐性幼虫で生きているというのもいるのでしょうか? 頂いた写真は確かに死んでいるように見えます。右下のは平面的でないのでよく分かりませんが、動くんでしたら生きているのでしょう。また、２ヶ月たったプレートということですと、生きているのは耐性幼虫の可能性が高いと思います。ゆっくり動くというのもそれに矛盾しません。写真の感じでも普通の幼虫のようにしゃかしゃか動いているようには見えませんね。 耐性幼虫でもそっとした状態で全く動かないわけではなく、ゆっくり動いているのも全然動かないのもある、ということです。蓋を開けて滅菌した楊枝かなにかで突っつくと動き出すものもいますが、蓋をあけるのが怖いようでしたら、プレートごと強くテーブルに打ち付けて振動を与えるというのでも動き出す虫がいると思います。繰り返しになりますが、お送り頂いた写真のものは完全に死んでいるので無理だと思いますが。耐性幼虫はプレートの状態によって（単に虫の密度ですが）、たくさん生じるときと少ししかできないときがありますので、いろいろ研究してみてください。 参考サイト 虫の集い http://www.wormjp.umin.jp/ 線虫 C.elegans の教材化（啓林館 授業実践記録） https://www.shinko-keirin.co.jp/keirinkan/tea/kou/jissen/seibutsu/201411/index.html/ |