東京農工大学遺伝子実験施設実習室
内容／野菜からDNAを抽出して分離・検出を行う。
講師／丹生谷　博（東京農工大学遺伝子実験施設助教授）、松下保彦（同　助手）
　　　　斎藤隆政（神奈川県立寒川高等学校教諭）、鈴木恵子（法政大学女子高等学校教諭）


植物体からのＤＮＡの抽出 （２人１組で実施）

目 的
　植物体からＤＮＡ（粗ＤＮＡ：主にＤＮＡだがＲＮＡを含む）を抽出する。

準 備 （材料・薬品・機具）
　植物体４ｇ（ブロッコリー・ホウレンソウ・カリフラワーなど）、液体窒素、ＤＮＡ抽出液（注１）、 クロロフォルム試薬（注２）、冷イソプロパノール（注３）、はさみ、乳鉢･乳棒１、軍手１、 薬さじ１、2ml駒込ピペット３、グラスロッド２（注４）、遠心チューブ50ml（オレンジキャップ）１、 遠心チューブ50ml（青キャップ）１、ウォーターバス、遠心分離機、遠心チューブ立て
方 法
  1. 植物体4ｇをはかり、はさみで細かく刻んでから、冷凍庫で十分に冷却（３０分以上）した乳鉢に入れる。（注５）
  2. 乳鉢に液体窒素を注ぎ入れ、凍結した植物体を、軍手を着用して乳棒で砕き抹茶状にする。どろどろとけてきたら液体窒素を補給する。ＤＮＡの収量を高めるために十分に砕くことと液体窒素が軍手に吸収されないように注意する。
  3. あらかじめＤＮＡ抽出液20mlを入れてウォーターバス（60℃）で温めておいた遠心チューブ50ml（オレンジキャップ）の中に、液体窒素で十分冷却した薬さじを使い手早く粉末状の植物材料を入れ、ダマにならないよう軽く撹拌する。
  4. 遠心チューブにキャップをし、６０℃のウォーターバスで２０分間、振とうしながらＤＮＡを抽出する。（注６）
  5. 教卓に用意されたクロロフォルム試薬を20ml持ち帰り、遠心チューブのキャップをはずして、管壁伝いにクロロフォルム試薬を静かに加える。
  6. 再び遠心チューブにキャップをし、静かなシーソー運動により水層とクロロフォルム層を１０分間混合する。（注７）
  7. 遠心チューブを、3000回転で１０分間の遠心分離にかける。この時、必ずバランスを確認、調整する。（注８）
  8. 遠心が終わった段階で遠心チューブ内は、上から順に、水層・中層（植物のかす）・クロロフォルム層からなる。ＤＮＡを含む上層の水層をピペットで別の透明な遠心チューブ（青キャップ）２本に移す（ほぼ均等になるように）。この時、水層を若干残してかまわないから中層が絶対に混入しないように注意する。
  9. 教卓に用意された冷却イソプロパノールを持ち帰り、各遠心チューブに７mlずつ冷却イソプロパノールを管壁伝いに静かに加え、キャップをして静かにシーソー運動で混合させる。しばらくすると境界面に白い糸状の物質が析出してくる。これがＤＮＡである。グラスロッドでこの糸状の物質を巻き取る。ただし、この段階の糸状の物質にはＲＮＡが混入している。（注９）
  10. 2本のうち１本から得られたＤＮＡサンプルは、15ml 遠心チューブ中の80％エタノールで洗浄し、軽く遠心分離にかけて液体成分を除き、ＴＥバッファー5mlを加えて溶解させる。これは、午後の電気泳動の試料に使用する。もう一方のＤＮＡサンプルは、アルミホイルに移し風乾してから重量を測定する。


（注１）
ＤＮＡ抽出液（100ml）の作り方
　20mM 　 EDTA 2Na（372.24） 　 0.7444 ｇ
　100 mM 　 Tris-HCl（121.14） 　 1.2114 ｇ
　1.4M 　 NaCl（58.4） 　 8.176 ｇ
　　＊2％ CTAB 　 2.0 ｇ
　　＊0.2％ 2-Mercaptoetanol 　 0.2 ml
＊印以外の薬品を溶かして、塩酸でｐH＝8.0に調整し、１５分間高圧滅菌を行う。
滅菌後に、＊印の薬品を加え全量を100mlにする。室温保存。 EDTAには、EDTA、EDTA 3Na、EDTA 4Naなどあるので、モル計算時には注意する。
（注２）
　クロロフォルム試薬（100ml）の作り方（遮光びんに入れ室温保存）
　クロロフォルム 　 96ml
　イソアミルアルコール 　 4ml

（注３）
　乳鉢・乳棒・イソプロパノールは、冷凍庫に入れ冷却しておく。
（注４）
　グラスロッドとは、ＤＮＡをつり上げる道具で、パスツールピペットの先端をガスバーナーで加熱して融かして丸め、先端をフック状に少し曲げたもの。
（注５）
　液体窒素で植物材料を凍結し破砕するメリットは、繊維が豊富な植物組織を石英砂など使わなくても容易にすりつぶすことができることである。材料がぱりぱりになって抹茶状にすりつぶせる過程は面白いものである。また、ＤＮＡ分解酵素のDNaseは至る所に存在しＤＮＡを切断（低分子化）する作用をもつが、凍結によりその活性を押さえることが可能である。化学の授業などと連携して液体窒素で実施すると生徒も喜ぶが、実際に高校現場ではその入手は難しいであろう。その場合は、事前に材料を計量して凍結させておいたり、刻んだ材料を、冷凍庫で十分に冷却した乳鉢に入れ少しの間冷凍庫で凍結させておいてもその感触は味わえる。時間的にそれも不可能な場合は、常温で処理してもあまり大差はないようなので、材料を破砕するときの温度について神経質になる必要はないが、しっかりすりつぶさないと収量に影響するので注意は必要である。
（注６）
　自動で動く振とう機がなくても、時々手動で振とうすることでも十分。また、この実験は、90分（２時間続き）の時間内で終わらせることができるが、抽出時間や遠心時間などいずれの過程も、時間短縮は可能である。抽出時間は１５分位まで、クロロフォルムによるタンパク質変性処理時間と遠心分離処理時間は５分位まで短縮しても可能である。
（注７）
　今回は、キャップ付の遠心チューブを使用しているが、試験管やキャップのないスピッツ管など使用する時は、メルク社製ダブルキャップが便利である。ゴム栓と違い、開口部を下にしても漏れる心配がなく、シーソー運動で静かに下層と上層の混合することに適している。
（注８）
　遠心分離機がない場合、純度にこだわらないならば、ろ過による方法も可能である。まず、ガーゼを使って植物のかすを大雑把に取り除き、次にろ紙（できれば粗い目のもの）でろ過をする。遠心分離のようにたんぱく質をしっかり取り除けないため白濁しているが、糸状のＤＮＡを巻き取ることができる。ただし、ＤＮＡにたんぱく質がいくらか巻き込まれてしまうと思われる。
（注９）
　いわゆる「エタ沈」といわれているように、エチルアルコールでかまわない。しかし、プロパノールの方が沈殿の効果が強く、抽出液に対して１ボリュームで沈殿効果があるが、エタノールを利用する場合は２ボリュームが必要でしっかり冷却しておく必要がある。 この処理では、核酸、つまりＤＮＡだけでなくＲＮＡも析出・沈殿する。シーソー運動で穏やかに攪拌する時、注意深く観察すると、境界面に生じたグラスロッドで容易に巻き取れる沈殿と巻き取れない細かくもやもやとした沈殿とが生じてくる。前者は高分子のＤＮＡに低分子のＲＮＡも巻き込まれたもの（粗ＤＮＡ）であり、後者は低分子のＲＮＡである。粗ＤＮＡを取り去った溶液を遠心分離にかければ、ペレット状のＲＮＡサンプルが得られる。粗ＤＮＡからＲＮＡを取り除き、厳密にＤＮＡのみを抽出するためには、RNaseでＲＮＡを分解処理しなければならない。

各試薬について（名称・分子式・働きなど）

ＥＤＴＡ ［　Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt ｴﾁﾚﾝｼﾞｱﾐﾝ四酢酸二ﾅﾄﾘｳﾑ　］
 　働き･･･二価金属イオンの強力なキレート剤。Mg２+を除き、DNase（DNA分解酵素）の活性を抑える。

Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ［　2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-Propanedio1　2-ｱﾐﾉ-2-ﾋﾄﾞﾛｷｼﾒﾁﾙ-1,3-ﾌﾟﾛﾊﾟﾝｼﾞｵｰﾙ
　別名　Tris(hydroxymethy1)aminomethane　ﾄﾘｽ(ﾋﾄﾞﾛｷｼﾒﾁﾙ)ｱﾐﾉﾒﾀﾝ　］
　働き･･･緩衝液、pHを一定に保つ。

ＣＴＡＢ［　Cety1 Trimethy1 Ammonium Bromide　ｾﾁﾙﾄﾘﾒﾁﾙｱﾝﾓﾆｳﾑﾌﾞﾛﾐﾄﾞ　
　別名　Hexadecyltrimethyl ammonium bromide　ﾍｷｻﾃﾞｼﾙﾄﾘﾒﾁﾙｱﾝﾓﾆｳﾑﾌﾞﾛﾐﾄﾞ　］
 　働き･･･界面活性剤。細胞の構造を溶かしてDNAを抽出しやすくする。温度が低いと溶けにくいので温めて溶かすとよい。

メルカプトエタノール ［　2-Mercaptoethanol 　ﾒﾙｶﾌﾟﾄｴﾀﾉｰﾙ　］
 　働き･･･安定剤。（省略しても問題はなさそう）

クロロフォルム ［　Chloroform　ｸﾛﾛﾌｫﾙﾑ　］
 　働き･･･タンパク質の変性剤。懸濁液中のタンパク質やＤＮＡに結合しているタンパク質を取り除く。また、懸濁液中のポリフェノールも取り除く。

イソアミルアルコール ［　Isoamylalcoho1 ｲｿｱﾐﾙｱﾙｺｰﾙ、 3-Methy1 buthyl alcohol　 3-ﾒﾁﾙ-ﾌﾞﾁﾙｱﾙｺｰﾙ　］
 　働き･･･安定剤。泡立ちを抑える 。（省略しても問題はない）

イソプロパノール 　［　Isopropylalcohol　ｲｿﾌﾟﾛﾋﾟﾙｱﾙｺｰﾙ　］
　働き･･･水層に溶けている核酸を析出・沈殿させる。